¿Cómo medir la fluorescencia de una muestra?

La espectroscopia de fluorescencia es una técnica analítica muy difundida, pero medir la fluorescencia de muestras desconocidas a menudo puede ser un desafío incluso para usuarios experimentados. A continuación se muestra un procedimiento para mediciones espectrales, para ayudar a los recién llegados al campo de la espectroscopía de fluorescencia. En otras notas (por el momento disponibles en inglés) sobre el efecto de filtro interno (https://www.edinst.com/blog/inner-filter-effect/) y sobre la resolución de problemas de mediciones espectrales (https://www.edinst.com/blog/fluorescence-spectroscopy-tutorial/), encontrará más consejos sobre las mediciones.

Cuando se mide la fluorescencia de una muestra desconocida, es una buena práctica comenzar con una medición de su absorbancia. Como la fluorescencia es directamente proporcional a la luz absorbida, debe determinarse la longitud de onda de absorción máxima. Algunos espectrómetros de fluorescencia como los modelos FLS1000 (https://www.edinst.com/products/fls1000-photoluminescence-spectrometer/) o FS5 (https://www.edinst.com/products/fs5-spectrofluorometer/) de Edinburgh Instruments, permiten medir la absorbancia además de la fluorescencia. Es una buena idea elegir una longitud de onda de excitación menor que este máximo, ya que podría haber cierta superposición entre los espectros de excitación y emisión.

El ejemplo anterior muestra un espectro de absorción de Antraceno en Ciclohexano adquirido con un espectrofluorómetro FS5. La absorbancia máxima es de aproximadamente 0.1, que es una buena concentración para evitar el efecto de filtro interno (https://www.edinst.com/blog/inner-filter-effect/). En base a esto, la longitud de onda de excitación podría ajustarse a ~ 355 nm o ~ 375 nm.

Luego, las longitudes de onda de absorción y emisión deben optimizarse para maximizar la señal de interés. Las ranuras de excitación y emisión de los monocromadores se pueden ajustar para dejar pasar más luz. Esto aumenta la señal, pero a su vez reduce la resolución espectral (es decir, qué tan bien resueltas están las líneas espectrales). La señal debe ser alta para obtener una buena relación señal/ruido, pero debe estar por debajo del límite de saturación del detector: demasiados fotones por segundo pueden alterar el comportamiento del detector y distorsionar los datos. El límite de saturación para un Fotomultiplicador estándar es de 1.5 millones de cps (cuentas por segundo).

Una vez que las condiciones se optimizaron, se pueden establecer los parámetros de medición en el software del espectrómetro. Los espectrómetros de Edinburgh Instruments permiten establecer el rango de longitud de onda, el tamaño del paso, el tiempo de permanencia (dwell time) y las repeticiones, como se muestra en la imagen siguiente. El tiempo de permanencia (tiempo de integración por puntoy escaneo) y el número de escaneos contribuyen al tiempo total de integración; por supuesto, mayores tiempos de integración aumentarán la calidad de los datos. Las opciones de substracción y corrección de fondo también están disponibles en el cuadro de diálogo.

El software plotea los datos a medida que los adquiere, lo que da como resultado un espectro de fluorescencia como el que se muestra a continuación.