¡Siempre hay algo para purificar!

O cómo el HPLC de escala preparativa puede estar al alcance de la mano

En diversos ámbitos es necesaria la purificación de una sustancia. Por ejemplo, un componente de un extracto natural que debe aislarse, o el producto final de una síntesis que debe limpiarse de subproductos problemáticos. ¿Cuál es el método más adecuado?

La cromatografía líquida es un proceso de separación extremadamente versátil, y es ideal para purificar una amplia variedad de mezclas de sustancias con alto rendimiento y pureza. ¿Qué hay que considerar, si el HPLC se va a utilizar de forma preparativa? ¿Qué componentes se necesitan?

En esta nota hablaremos sobre la técnica de HPLC de escala preparativa, conocerá una herramienta de conversión práctica, y presentaremos un sistema ideal para el comienzo, que luego crecerá fácilmente cuando sea necesario.

¿Qué purificaciones se realizan comúnmente con un HPLC?

Algunos ejemplos: Mezclas de drogas enantioméricas, Canabinoides, Vainillina, Estrógenos, Insulina, Pigmentos naturales de vegetales, ADN y Oligonucleótidos, Beta-Caroteno, Vitaminas, Fosfolípidos en lecitina, o Componentes de la tintura madre de Ginkgo Biloba, entre muchas otras aplicaciones.

HPLC de escala preparativa Azura Lab Prep

Lo básico

¿Cómo empezar con el HPLC de escala preparativa?

En el escenario analítico, es importante identificar tantos componentes de una muestra como sea posible y/o determinar su concentración, mientras que a escala preparativa a menudo sólo se necesita obtener uno o pocos productos con un requerimiento específico de pureza. Usar el mayor volumen de inyección posible y lograr un bajo consumo de solvente, es importante a escala preparativa.

HPLC Analítico y Preparativo comparados

	HPLC de escala Analítica	HPLC de escala Preparativa
Objetivo de la separación	Realizar un análisis Cuali o Cuantitativo	Purificar un producto
Cromatograma buscado	Tantos picos como sea posible, separados a línea de base	Sólo hay interés en el pico del producto a purificar
Volumen de inyección	Tan bajo como sea posible (1 a 20 µl por inyección)	Tanto como sea posible, sin superposición > 20 µl
Tipo de inyección	Preferentemente con autosampler (muchas muestras de poco volumen)	Generalmente manual (pocas muestras de gran volumen)
Diámetro interno de la columna	1 a 4 mm (para minimizar la dispersión y ensanchamiento de picos, lo que requiere trabajar con altas presiones)	> 4 mm (el ensanchamiento de picos no suele ser un problema, y se requiere gran capacidad de la columna)
Tamaño de partícula	< 5 µm	> 5 µm
Flujo	Aprox 1 ml/min	5 a 5000 ml/min
Presión	100 a 1500 bar	Hasta 20 bar
Detección	Tan sensible como sea posible	Sólo monitoreo. La saturación puede ser problemática
Forma de los picos	Gaussiana, para un mejor análisis	No es importante, siempre que el pico del producto sea limpio
Recolección de fracciones	No	Sí, automatizada
Costo del solvente	Bajo	Alto
Recuperación del solvente	Generalmente no	Es deseable el reciclado
Gradiente	Optimiza la separación y la velocidad	Interfiere con el reciclado del solvente

¿Qué tipo de equipo se necesita?

Su sistema de HPLC necesitará un dispositivo de recolección para los picos de elución. Este puede ser un colector de fracciones para fraccionar toda la corrida, o una válvula de conmutación sencilla de varias posiciones multipuerto, con usualmente 6 a 16 posiciones de conmutación. Cuando calcule el número de posiciones de válvula requeridas para las fracciones, reserve al menos una para el reciclaje de solventes y otra para el desecho. Mejor, pero también un poco más costoso, es contar con una válvula de desvío adicional.

Cómo ajustar (o escalar) el método de HPLC

La forma más fácil de escalar un método de separación es tener una separación isocrática como modelo. Considere la posibilidad de usar un solvente económico para este modelo de separación, e intente prescindir de acetonitrilo. El etanol o el metanol son mucho más baratos. Además, una ampliación lineal, en la que solo se cambia el diámetro de la columna, manteniendo la misma longitud y tamaño de partícula, es la conversión más sencilla.

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Por supuesto, cuanto más frecuente o más grande sea su purificación, más rentable será optimizarla. Por ejemplo, puede ser útil cambiar de un método de fase reversa a uno de fase normal, porque la capacidad de carga es significativamente mayor, si trabaja con productos no polares. Las ventajas también pueden ser aguas abajo, cuando un solvente particular puede facilitar el paso de concentración final de la sustancia purificada.

Conversor de ScaleUp KNAUER

No es necesario usar fórmulas para calcular los parámetros de su método de ampliación cuando cambie de HPLC analítico a preparativo. KNAUER ScaleUp Converter es una herramienta de optimización de métodos fácil de usar que hará la conversión necesaria.

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