La prueba de Tanaka y la elección de la columna de HPLC

No todas las columnas de C18 son iguales

La fase reversa es, por lejos, el modo de HPLC más utilizado (con más del 90 % de las aplicaciones de HPLC). Las columnas C18 (Octadecil Silano) son las más utilizadas y difundidas. Aunque el código de columna de USP (L1) ((https://www.knauer.net/Dokumente/columns/lc_columns/guides/USP_codes_KNAUER%20phases_171122.pdf)) es el mismo para todas las fases de C18, hay muchas diferencias que se deben tener en cuenta al elegir la columna correcta. C18 siempre es una buena opción para un intento inicial, pero hay que tener en cuenta que no todas las fases C18 tienen las mismas características. Para diferenciar entre tales fases, los gráficos de Tanaka son extremadamente útiles.

INTRODUCCIÓN

La prueba de Tanaka es un método estándar aceptado para la evaluación del rendimiento y la selectividad de una columna de HPLC de fase reversa. El protocolo de Tanaka se basa en seis variables: factor de retención hidrofóbico, selectividad hidrofóbica, selectividad estérica o de forma, capacidad de enlace de hidrógeno, capacidad de intercambio iónico total, y capacidad de intercambio iónico ácido. Aquí nos centramos en la retención hidrofóbica, la selectividad hidrofóbica y la selectividad de forma de las siguientes fases de KNAUER C18: Eurospher II C18 (ES II C18), Eurospher II C18 A (ES II C18 A), Eurospher II C18 H (ES II C18 H), Eurospher II C18 P (ES II C18 P), Eurospher I C18 (ES I C18) y Eurosil Bioselect C18 (EB C18) . La capacidad de enlace de hidrógeno y la capacidad de intercambio iónico no se consideran aquí, porque son muy similares para las fases examinadas. El factor de retención hidrofóbico (HR) refleja el área de superficie y cobertura de superficie (densidad de ligando). La selectividad hidrofóbica (HS) es una medida de la cobertura superficial de la fase como la selectividad entre alquilbencenos (selectividad para el grupo Metileno, CH2). La selectividad de forma (SS) es una dimensión que está influenciada por el espaciamiento de los ligandos y probablemente también por la forma y funcionalidad del reactivo sililante.

RESULTADOS

Se utilizó un diagrama de red hexagonal para mostrar los parámetros medidos de Tanaka, ya que permite una buena comparación visual de las fases. Para este tipo de diagrama, los valores medidos se multiplican por ciertos factores. Los valores medidos sin multiplicadores se muestran en la Tabla A1, en la sección de resultados adicionales. Las figuras 1 a 3 muestran los gráficos de Tanaka para las fases probadas. Los valores para la capacidad de intercambio iónico y la capacidad de enlace de hidrógeno son bastante similares para todos y, por lo tanto, no se consideraron. La mayor diferencia entre las fases probadas podría verse cuando se compara el factor de retención hidrofóbico (HR): cuanto mayor es este valor, menos polar es la modificación. La clasificación de las fases con retención hidrofóbica ascendente conduce al siguiente orden: EB C18> ES II C18 A> ES I C18> ES II C18> ES II C18 H> ES II C18 P. El valor para la selectividad de forma de la fase Eurospher I está ligeramente desviada. Esto puede deberse a un Taponado final incompleto.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para la determinación de los parámetros de Tanaka se utilizó el Sistema Educativo KNAUER AZURA®. El método funcionó isocráticamente con una composición de fase móvil de Metanol:Agua 80:20 (v/v). El termostato de columna AZURA® CT 2.1 se ajustó a 30 °C y el detector UV se ajustó a 254 nm. Todas las columnas usadas tenían una dimensión de 150 x 4 mm ID y se rellenaron con Eurospher II 100-5 C18, Eurospher II 100-5 C18 A, Eurospher II 100-5 C18 H, Eurospher II 100 5 C18 P, Eurospher I 100-5 C18 y Eurosil Bioselect 300-5 C18. Este método se usó solo para la determinación de HR, HS y SS. Los parámetros de métodos detallados para HBC e IEX se adjuntan en la sección de materiales y métodos adicionales (Tablas A3 y A4).

CONCLUSIÓN

Los resultados obtenidos de la comparación de la prueba de Tanaka se pueden usar para ayudar en la elección de la columna más apropiada para una separación determinada. También es importante saber lo más posible sobre las propiedades químicas del analito. Un analito que sólo es soluble en un solvente con una alta cantidad de fase orgánica tendrá una retención leve o nula en una fase C18 A. Sin embargo, la fase C18 A puede funcionar con eluyente acuoso al 100% sin destruir la fase estacionaria. Inversamente, un analito muy polar podría tener menos retención en el C18 P o modificación C18 H. Sin embargo, debido a su alto contenido de carbono, proporcionan una alta estabilidad de pH en un rango de pH extendido. Además, si el peso molecular del analito es superior a 2000 Da, un tamaño de poro de 100 Å puede ser insuficiente, lo que hace que Eurosil Bioselect con un tamaño de poro de 300 Å la mejor opción. La cartera de columnas de KNAUER, con más de 6000 opciones, ofrece fases C18 clásicas y especiales, lo que facilita encontrar la columna más apropiada para cada aplicación.

REFERENCIAS