HPLC: ¿Quién es quién?

HPLC  High Performance Liquid Chromatography

Es una cromatografía en columna usada en Química Analítica y Bioquímica. Como en toda cromatografía, el objetivo es separar los componentes de una mezcla para cuantificarlos, o bien obtenerlos puros. La muestra debe estar solubilizada. La fase móvil es un solvente o mezcla de solventes, y la fase estacionaria - empacada dentro de una columna de acero - es un sólido fino que recubre pequeñas partículas de tamaño uniforme (de usualmente, 2 a 10 µm). Los detectores más comunes son UV - Visible, Arreglo de diodos, y de Fluorescencia. También se puede acoplar a un espectrómetro de masas (HPLC-MS). Determinaciones típicas: fármacos, antioxidantes, aminoácidos, hidratos de carbono, aflatoxinas, contaminantes, estupefacientes, etc. Con un mismo sistema se pueden utilizar dos técnicas distintas: de fase normal, y de fase reversa, y según la técnica cambiarán la columna y la fase móvil utilizada.

Fase normal
Los compuestos se separan en función de su polaridad. La fase estacionaria es polar, y la fase móvil, apolar. Se utiliza cuando el analito es polar, y hoy en día es mucho menos utilizada que la cromatografía en fase reversa. Se utiliza para determinaciones de sustancias como tocoferoles, corticosterona, anilinas, aminas, vitaminas, etc.

Fase reversa
Es tan difundida, que suele denominarse simplemente HPLC. La fase estacionaria es apolar (generalmente sílica modificada), y la fase móvil es polar (agua, metanol, acetonitrilo, etc). Las moléculas polares eluyen más rápidamente. Esta técnica se basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas entre los analitos y la sílica modificada. La gran mayoría de los métodos de HPLC utilizan esta técnica.

HPLC de escala Preparativa y Semipreparativa

Cuando se quieren purificar pequeñas cantidades de componentes (menos de 0,5 gramos), se utiliza  un HPLC de Escala Semipreparativa, lo que requiere un equipo distinto al utilizado para HPLC de escala analítica (mayores flujos de fase móvil, distintas columnas, mayores volúmenes de solventes). Estos equipos permiten la identificación y la purificación de proteínas, enzimas, compuestos naturales, metabolitos de drogas, etc. Para purificar cantidades de componentes mayores a los 0,5 gramos (hasta usualmente los 2 gramos), se utiliza un HPLC de Escala Preparativa, en la que el flujo de fase móvil suele ir de los 50 a los 1000 ml/min.

UHPLC Ultra High Performance Liquid Chromatography

Es una técnica con la que se logra mayor velocidad de análisis y mayor resolución que con un HPLC tradicional. El tamaño de las  partículas es usualmente de 2 µm o menos, y se requiere de una bomba distinta a la del HPLC, ya que la presión de trabajo puede llegar a más de 1000 bar y el flujo, a 5 ml/min.

IC  Ionic Chromatography

La Cromatografía de intercambio iónico, separa los componentes en función de la atracción electrostática entre los iones en solución y las cargas en la fase estacionaria. Existen tanto el intercambio catiónico como el aniónico. La fase móvil es una solución iónica, y la fase estacionaria es una columna empacada conteniendo una resina de intercambio. Se utiliza para determinaciones de iones en agua, ácidos en jugos, aniones en surfactantes, azúcares en bebidas, etc.

FPLC  Fast Protein Liquid Chromatography / SEC / GPC

Es una técnica utilizada para el análisis o la purificación de  mezclas de proteínas o biomoléculas. La fase móvil es un buffer, y la fase estacionaria es una resina de intercambio. Según la cantidad de muestra, el flujo puede ir de 0,02 (escala de laboratorio) a 1000 ml/min (planta piloto). Usualmente, las presiones son bajas (< 20 bar), lo que evita el daño de los analitos. Los materiales deben ser biocompatibles (teflon, cerámicos, titanio, peek en lugar de acero). La fase estacionaria tiene polímeros de agarosa en lugar de sílica. Las columnas suelen ser de vidrio. Aplicaciones comunes: Separación de gamaglobulinas, polisacáridos, vitaminas, y aplicaciones sobre suero humano (anticuerpos). La Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), y la Cromatografía de permeación en gel (GPC), muy similares, separan componentes en función de su tamaño, no de la química, y se utilizan para la determinación de propiedades de polímeros, caracterización de polisacáridos, etc.

• Información sobre columnas Knauer®:

http://www.agsanalitica.com/es/categoria/Columnas-de-HPLC

https://www.knauer.net/en/Systems-Solutions/LC-Columns#Brands

• Información sobre HPLC:

http://www.agsanalitica.com/es/categoria/Cromat%C3%B3grafos-L%C3%ADquidos-(HPLC)

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